天凈沙 可調(diào)式易錯(cuò) PCR 試劑盒
211216-100 天凈沙 可調(diào)式易錯(cuò) PCR 試劑盒，產(chǎn)品簡(jiǎn)介：產(chǎn)品品牌：天凈沙產(chǎn)品名稱：可調(diào)式易錯(cuò) PCR 試劑盒產(chǎn)品貨號(hào)：211216-100產(chǎn)品規(guī)格：100次
天凈沙211216-100可調(diào)式易錯(cuò) PCR 試劑盒
北京天凈沙基因科技有限公司，是一家聚焦科研試劑、動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫、分子診斷的研發(fā)和生產(chǎn)企業(yè)。
211216-100 天凈沙 可調(diào)式易錯(cuò) PCR 試劑盒，產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
產(chǎn)品品牌：天凈沙
產(chǎn)品名稱：可調(diào)式易錯(cuò) PCR 試劑盒
產(chǎn)品貨號(hào)：211216-100
產(chǎn)品規(guī)格：100次
211216-100 天凈沙 可調(diào)式易錯(cuò) PCR 試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)
易錯(cuò)PCR（Error-prone PCR）是利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校對(duì)功能的特性，在一定條件下（如不同的dNTP濃度、Mg濃度和MnCl2存在）能夠按較高的機(jī)率引入隨機(jī)引入突變。如果有適當(dāng)?shù)倪x擇方法，則可從構(gòu)建的突變庫(kù)選出所需突變體。本產(chǎn)品是在本公司的易錯(cuò)PCR試劑盒的基礎(chǔ)上改進(jìn)而得，本
產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，十分簡(jiǎn)單方便，尤其在生物制藥和酶學(xué)研究領(lǐng)域顯示出了它的*性。
2. 配方經(jīng)過(guò)精心優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)人員在一定范圍內(nèi)可以控制突變率，一輪PCR的突變率范圍在2-8突變/1000bp，更高的突變率可以通過(guò)多輪PCR達(dá)到。
3. 可用于連續(xù)易錯(cuò)PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次易錯(cuò)PCR的產(chǎn)物用作下一次易錯(cuò)PCR的模板即可，使每一次獲得的小突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。
4. 可以擴(kuò)增的DNA片段更長(zhǎng)，達(dá)到2kb，對(duì)于2kb以上的產(chǎn)物，建議分段擴(kuò)增。
5. 本試劑盒足夠100次30uL體系的易錯(cuò)PCR。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
本產(chǎn)品采用五孔盒包裝
成份 | 編號(hào) | 規(guī)格 | 包裝材料 |
可調(diào)易錯(cuò)PCR專用 Taq DNA聚合酶（5U/uL） | 101005c | 50 uL | 0.5mL紅蓋管 |
5×可調(diào)易錯(cuò)PCR Mix（含dNTP | 211216a | 600 uL | 0.5mL黃蓋管 |
可調(diào)易錯(cuò)PCR專用MnCl2 | 211216c | 300 uL | 0.5mL紫蓋管 |
可調(diào)易錯(cuò)PCR專用dGTP | 211216d | 300 uL | 0.5mL藍(lán)蓋管 |
10×可調(diào)易錯(cuò)PCR追加dNTP | 211216e | 300 uL | 0.5mL本色管 |
使用手冊(cè) | 211216sc | 1份 | 無(wú) |
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存, 有效期為一年
自備試劑
引物、DNA模板、常規(guī)PCR試劑盒
使用方法
1. 將引物稀釋到10uM。引物也是決定易錯(cuò)PCR成敗的關(guān)鍵因素，設(shè)計(jì)引物時(shí)要保證其Tm在70℃，長(zhǎng)度在25-30nt之間，GC含量在45%-60%之間，3端GC含量低，并且沒有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
2. 用自備易錯(cuò)PCR引物和自備的常規(guī)PCR試劑擴(kuò)增制備易錯(cuò)DNA模板（常規(guī)PCR產(chǎn)物），膠回收并準(zhǔn)確確定濃度。注意：易錯(cuò)PCR的模板一定要用膠回收的常規(guī)PCR產(chǎn)物，因?yàn)槟z回收會(huì)可以把電泳不可見的非特異性擴(kuò)增片段去除，否則這些片段由于也是用易錯(cuò)PCR引物擴(kuò)增所得，在易錯(cuò)PCR擴(kuò)增時(shí)也會(huì)被擴(kuò)增，產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)抑制，降低靶分子的擴(kuò)增效率。
3. 將回收的DNA片段（模板）稀釋到1ng/uL 、10ng/uL和100ng/uL三個(gè)濃度。注意：模板使用量是影響突變率的最重要因素，模板DNA為非突變DNA，擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA為突變DNA，易錯(cuò)PCR體系最終DNA量是基本固定的，因此模板DNA使用量越大，則突變DNA在終產(chǎn)物中的相對(duì)比例就越低，突變率就越低。故建議同時(shí)測(cè)試三個(gè)模板用量。如果都成功，則優(yōu)先選用模板濃度低的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。
4. 根據(jù)每1000bp的預(yù)期突變數(shù)按下表確定30uL易錯(cuò)PCR體系中MnCl2和dGTP的用量（這是在模板DNA不超過(guò)1ng的前提下的數(shù)據(jù)）。表中的Mn表示可調(diào)易錯(cuò)PCR專用的MnCl2, dG表示可調(diào)易錯(cuò)PCR專用的dGTP：
預(yù)期突變數(shù) | 2個(gè) | 3個(gè) | 4個(gè) | 5個(gè) | 6個(gè) | 7個(gè) | 8個(gè) |
Mn用量（uL） | 0 | 1.0 | 2.5 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
dG用量（uL） | 0 | 0 | 0 | 1.0 | 2.0 | 3.0 | 4.0 |
5. 設(shè)置30uL體系的可調(diào)易錯(cuò)PCR：第一次建議設(shè)置3個(gè)模板濃度。在3干凈的PCR管中，分別加入下列成分。最后加可調(diào)易錯(cuò)PCR專用MnCl2
成分 | 模板用量1 | 模板用量2 | 模板用量3 |
可調(diào)易錯(cuò)PCR Mix, 5× | 6 uL | 6 uL | 6 uL |
可調(diào)易錯(cuò)PCR 專用dGTP | 根據(jù)上步用量表表選擇 | 根據(jù)上步用量表表選擇 | 根據(jù)上步用量表表選擇 |
自備DNA模板 | 1 uL （1ng/uL） | 1 uL （1ng/uL） | 1 uL （1ng/uL） |
自備PCR引物 (10 uM each) | 1 uL each | 1 uL each | 1 uL each |
可調(diào)易錯(cuò)PCR專用 Taq DNA聚合酶 | 0.5 uL | 0.5 uL | 0.5 uL |
可調(diào)易錯(cuò)PCR 專用MnCl2 | 根據(jù)上步用量表表選擇 | 根據(jù)上步用量表表選擇 | 根據(jù)上步用量表表選擇 |
自備超純水 | 補(bǔ)水到30uL | 補(bǔ)水到30uL | 補(bǔ)水到30uL |
6. 按已經(jīng)優(yōu)化的常規(guī)PCR條件進(jìn)行易錯(cuò)PCR：
PCR前變性 | 94℃ 3分鐘 |
易錯(cuò)PCR(循環(huán)30-60次 | 94℃ 1分鐘 |
60℃ 1分鐘 | |
72℃ 3-10分鐘 |
注：由于易錯(cuò)PCR含高濃度的鎂離子，因此容易形成引物二聚體，因此需要使用較高的復(fù)性溫度，以避免小片段擴(kuò)增產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)性抑制PCR。易錯(cuò)PCR一般不需要熱啟動(dòng)，也不需要在易錯(cuò)PCR結(jié)束后做延伸處理。易錯(cuò)PCR循環(huán)次數(shù)越多，突變DNA（擴(kuò)增產(chǎn)物）與非突變DNA（原始模板）的比例就越高。此外在突變率和模板長(zhǎng)度恒定的情況下，擴(kuò)增次數(shù)越多，發(fā)生突變的絕對(duì)數(shù)就越高，在同一模板上發(fā)生的突變位點(diǎn)數(shù)就越多，所以如果需要，可以做30、35、40、45、50、55、60次7個(gè)循環(huán)數(shù)的比較
7. 易錯(cuò)PCR結(jié)束后，取3uL進(jìn)行電泳檢查。
8. 如果有預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物，則全部電泳，進(jìn)行膠回收，再進(jìn)行克隆和測(cè)序等后續(xù)操作。如果需要增加突變率，可以選擇一個(gè)突變后的DNA為模板，再進(jìn)行下一輪易錯(cuò)PCR。
9. 如果沒有預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物，可以按下列操作追加進(jìn)行一輪常規(guī)PCR（追加PCR）。
10. 在PCR管中，加入3uL 10×可調(diào)易錯(cuò)PCR專用追加dNTP到27uL電泳剩下的PCR體系中，按下表進(jìn)行追加PCR（chasing PCR）。注意追加PCR只做20次循環(huán)。
步驟 | 參數(shù) | 循環(huán)數(shù) |
追加PCR | 94℃ 1分鐘 | 循環(huán)20次 |
60℃ 1分鐘 | ||
72℃ 1分鐘 |
11. 追加PCR結(jié)束后，再電泳檢測(cè)。如果有條帶，再進(jìn)行克隆和測(cè)序等后續(xù)操作。如果需要增加突變率，可以選擇一個(gè)突變后的DNA為模板，再進(jìn)行下一輪易錯(cuò)PCR。
12. 如果沒有預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物，則需要分析原因
疑難解答
Q：現(xiàn)象：沒有PCR產(chǎn)物。
A：可能原因：一是引物沒有優(yōu)化，可以重新設(shè)計(jì)引物；二是模板DNA太少，可以增加用量；三是模板不純，最好先膠回收；四是DNA溶液中有EDTA，可以適當(dāng)補(bǔ)加Mg++。
Q：現(xiàn)象：太多的PCR條帶或PCR條帶模糊一片。
A：可能原因：一是模板有膠回收、二是PCR循環(huán)數(shù)太多；三是復(fù)性溫度太低；四是引物沒有優(yōu)化；五是PCR條件沒優(yōu)化，可以使用touch-down PCR。
Q: 如果需要更高的突變率，如何辦？
A: 可以使用連續(xù)多次易錯(cuò)PCR來(lái)提高突變率。但最好先用膠純化回收易錯(cuò)PCR片段,再用于下一輪易錯(cuò)PCR。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品
易錯(cuò)PCR試劑盒
