Western blotting檢測試劑盒（DAB） NobleRyder P0910
北京諾博萊德科技有限公司供應Western blotting檢測試劑盒（DAB） NobleRyder P0910量大優(yōu)惠，咨詢 ：
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P0910 | Western blotting（小鼠IgG）DAB檢測試劑盒 | 920 |
P0920 | Western blotting（兔IgG）DAB檢測試劑盒 | 920 |
P0930 | Western blotting（山羊IgG）DAB檢測試劑盒 | 920 |
試劑盒組成
1. 封閉試劑：30g（可配制400ml）脫脂奶粉及其他蛋白，緩沖鹽等混合物。
2. 10倍濃縮抗體稀釋液，50ml。
3. HRP標記二抗，0.5ml，效價1：400。
4. DAB顯色液（20×），5ml A+5ml B。
原理：
SDS-PAGE電泳后，蛋白質按照分子量大小分離，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）后，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色以檢測電泳分離的特異性的蛋白。
操作步驟：
常規(guī)電泳轉膜后，
1） 清洗轉印膜：將膜剝離下后，作好標記，一般在左上角剪一缺口。室溫用TBS-T漂洗3次每次5min,以盡量洗去轉印膜上的SDS，防止影響后面的抗體結合。
2） 按5g封閉試劑加100ml雙蒸水計，配制膜封閉液，配好的膜封閉液為乳白色懸液，將漂洗過的轉印膜，封閉液內(nèi)，搖床震動，室溫封閉30min。 A@ 3） 用TBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次每次5min。
3）將10×抗體稀釋液用雙蒸水稀釋成1×（10ml 10×抗體稀釋液加入90ml雙蒸水，混勻，可4℃保存三個月）。此稀釋液可作為一抗和二抗的稀釋液。
4）用1×的抗體稀釋液稀釋抗體。根據(jù)用量以及一抗的推薦稀釋濃度來稀釋一抗。將雜交膜放入雜交袋中，加入一抗工作液，封口，4℃孵育過液或37℃搖動孵育2h。此用過的抗體一般可回收第二天再使用一次。注：如果所加一抗不同，可在此步將膜沿電泳方向剪成條，分別作好標記，分開孵育。
5）用TBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次每次5min。
6）用稀釋好的抗體稀釋液稀釋抗體。根據(jù)用量，按10ml抗體稀釋液加入10ulHRP標記二抗的比例，配制二抗工作液。將雜交膜放入雜交袋中，加入加入二抗工作液，封口，4℃孵育過液或37℃搖動孵育2h。此用過的抗體一般可回收第二天再使用一次。
7）用TBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次每次10min。
8）配制DAB顯色：根據(jù)用量，取TBS-T 4ml，加入DAB顯色液A、DAB顯色液B各200ul，混勻，加在膜正面，室溫下顯色。在目標條帶顯出后，而且背景未出時，放入水中終止顯色。
注意事項：
1， 請根據(jù)一抗來源選擇試劑盒。括號里面代標一抗的來源而不是標本的來源。
2， western blotting DAB顯色法操作簡單，但其敏感性與ECL發(fā)光發(fā)有一定的差距，一般只適用于豐度較高的蛋白。
3， 可以根據(jù)顯色結果來優(yōu)化實驗反應時間。如背景過深，可延長膜封閉時間，加長zui終漂洗次數(shù)與時間。如果條帶過弱，可延長抗體孵育時間。
4， 如果*沒有條帶，請檢查前期蛋白處理及實驗過程， 如果確認無誤，反復兩次依舊無結果，請換用ECL發(fā)光法顯色。
5， TBS-T（0.01M）配制方法：稱取NaCl 8.5g ，Tris 1.21g ，用800ml的雙蒸水溶解，用鹽酸調PH到7.6，再加入0.5ml Tween－20，用雙蒸水 加至1000ml，混勻即可。（也可按照自己的配制習慣來配制）
北京諾博萊德科技有限公司位于北京市海淀區(qū)，是一家專業(yè)從事生化試劑、分子生物學試劑、實驗耗材及實驗儀器研發(fā)、銷售、服務為一體的生物科技公司，公司主要經(jīng)營的進口品牌包括Qiagen, Omega, Sigma, Invitrogen, Roche, Abcam, Santa cruz, Fermantas（MBI）, NEB, BD, Peprotech, Abnova, R&D systerms, GE, Biovision, Millipore, Amresco, Merck, CST, Axygen, Corning, NUNC, Thermo fihser, Eppendorf等；產(chǎn)品涉及化工原料、生化試劑、分子克隆相關試劑、細胞培養(yǎng)及檢測常用試劑、實驗室常用耗材及儀器。
Western blotting檢測試劑盒（DAB） NobleRyder P0910
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